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      【熱門應用】乳清蛋白(WPI)在多檢測器SEC應用表征

      發布時間:2022-09-14      點擊次數:231


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      乳清蛋白(WPI)在多檢測器SEC應用表征




      #本文由馬爾文帕納科應用專家馮慧慶供稿#

      2022 


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      什么是乳清蛋白?它有什么作用?


      乳清是奶酪制作過程中的副產品,而乳清蛋白(WPI)是一種膳食補充劑和食品成分,是從牛奶中分離出來的。它含有很高比例的純蛋白質,純度可達90%以上,幾乎不含乳糖、碳水化合物、脂肪和dan固醇。


      乳清蛋白具有很高的營養價值,已成為各種保健食品中功能性成分的重要來源。它被廣泛用于嬰兒配方奶粉中,為最佳生長發育提供天然的氨基酸來源,也經常在食品工業中用作乳化劑和穩定劑。WPI在運動員中也很受歡迎,因為它能夠被非常迅速地消化,并幫助鍛煉后的身體從分解代謝狀態恢復到合成代謝狀態。據有些應用表明,WPI可能具有抗炎或抗癌的作用。


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      乳清蛋白是由什么組成的?


      乳清蛋白由以下四種主要成分組成:


      β-乳球蛋白

      β-乳球蛋白是牛和羊乳清蛋白的主要成分,也存在于許多其他哺乳動物中。然而,它不存在于人類母乳中。大約85%的牛奶過敏性兒童在3歲前就不會過敏了,但其余15%的兒童仍對牛奶過敏。牛β-乳球蛋白是牛乳中的主要過敏原,因此乳制品生產商需要證明β-乳球蛋白的存在或不存在,以確保其標簽滿足牛奶過敏癥的要求。β-乳球蛋白是一種相對較小的蛋白質,由162個氨基酸組成,分子量為18.4kDa,在生理條件下主要以二聚體形式存在。

      α-乳蛋白(α-lactalprotein)

      α-乳蛋白(α-lactalprotein)是一種存在于幾乎所有哺乳動物乳汁中的蛋白質,與乳糖的產生有關。分子量為14,178 kDa。

      血清白蛋白

      血清白蛋白是由肝臟產生的,其主要功能是作為血液中類固醇、脂肪酸和甲狀腺激素的載體蛋白,并通過增加腫瘤性壓力在穩定細胞外液容量方面發揮重要作用。血清白蛋白是一種球形水溶性蛋白質,分子量約為65 kDa。

      免疫球蛋白(Ig)

      免疫球蛋白(Ig),也被稱為抗體,被免疫系統用來識別和中和異物,如細菌和病毒。在胎盤哺乳動物中有五種抗體亞型,即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。典型的免疫球蛋白分子量為150 kDa。


      在本文,使用OMNISEC多檢測器系統對WPI乳清蛋白樣品進行表征。對混合物中的4種主要成分進行了分離,并分別進行測定。


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      乳清蛋白樣品表征方法


      使用馬爾文帕納科的OMNISEC多檢測器系統對乳清蛋白樣品進行分析,使用示差檢測器(RI)、紫外檢測器(PDA)、7°角光散射+90°角光散射(LALS/RALS)和粘度(IV)檢測器。樣品用馬爾文P柱(300×7.8 mm ID)分離,1×P4000和1×P3000柱分離。


      流動相為0.1M pH7.0磷酸鹽緩沖液,每次進樣總物質約500μg。用OMNISEC軟件中的共聚分析計算對色譜圖進行分析。所有蛋白的dn/dc是0.185。


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      OMNISEC分析結果

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      色譜峰3的分子量為33 kDa,質量分數為75%,與β-乳球蛋白相對應,清楚地表明它是乳清蛋白中的主要成分。β-乳球蛋白單體的分子量為18.4kDa,但它在活性狀態下以二聚體的形式存在,因此,盡管略有差異,但33 kDa的峰仍然表明是二聚體。


      α-乳蛋白(色譜峰4)的分子量為15 kDa,與理論值相符。一個有趣的發現是,α-乳蛋白的RI峰(測量濃度)的峰高不到β-乳球蛋白的一半,而兩者的紫外信號高度非常相似。這表明α-乳蛋白在280nm處的消光系數高于β-乳球蛋白。


      根據分子量將70K峰和150K峰分別認定為血清白蛋白和免疫球蛋白。所有四個峰的Pd值都很小,這與預期一致,這是因為蛋白質總是有一個窄的Pd值。


      從分離機理來看,流體力學半徑值隨保留體積的增加而減小,證實了低分子量蛋白質的尺寸較小。特性粘度值也隨著分子量的增加而降低,但不是線性的,反映了蛋白質結構的不同。β-乳球蛋白二聚體的特性粘度最清楚地說明了這一點,盡管其分子量是α-乳球蛋白單體的兩倍,但僅比其值高出15%。這表明二聚體β-乳球蛋白的結構比α-乳蛋白更致密。


      聚集體

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      在10-12mL的低保留體積下,LALS和RALS檢測器均出現單峰,而RI和UV檢測器則完全沒有峰。RI和UV信號與濃度成正比,因此該峰的濃度一定很低。


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      從瑞利散射方程得知,光散射強度與分子量乘以濃度成正比,因此分子量必須非常大才能在光散射圖中顯示色譜峰信號。該聚集體以較低的保留體積洗脫出來,粘度檢測器中也沒有峰。這表明這些聚集體非常致密,具有較低的特性粘度,而不是纖維狀或其他結構,因此粘度檢測器沒有檢測到色譜峰信號。


      實驗結論

      Conclusion


      本文數據表明,OMNISEC多檢測器系統可以用來表征復雜的蛋白質混合物,如WPI中的蛋白質。本文對乳清蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、β-乳球蛋白和α-乳蛋白的濃度、分子量、流體力學半徑和結構進行表征,通過一次上樣測試,就可以得到全面的數據,測試過程簡單、高效、準確。


      同時,一些蛋白質多聚體也可以清晰地被光散射檢測器識別出來,盡管這些聚集體的濃度很低。OMNISEC多檢測器系統在此類應用中的拓展使用使其成為食品和營養方面或其他與蛋白質相關的應用(如生物制藥研究)的理想選擇。



      OMNISEC

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      OMNISEC 尺寸排阻色譜儀

      OMNISEC是個多檢測器SEC系統,包括示差檢測器(RI)、紫外檢測器(UV)、光散射檢測器(LS)和粘度檢測器(IV)??梢杂糜诟叻肿幽?、天然高分子以及蛋白質的分析:


      • 靈敏的光散射檢測器

      • 極限穩定性,針對低濃度樣品具有更高的靈敏度

      • 自平衡粘度計檢測器

      • 寬紫外/可見光波長范圍,應用更廣泛

      • 更人性化的設計,運用簡便、直觀



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